Baltymų, išskirtų iš melsvabakterių biomasės, kiekinė – kokybinė analizė ir hemagliutinacinio aktyvumo tyrimas in vitro

Abstract

A. Paurytės magistro baigiamasis darbas: „Baltymų, išskirtų iš melsvabakterių biomasės, kiekinė – kokybinė analizė ir hemagliutinacinio aktyvumo tyrimas in vitro“. Magistrinio darbo vadovė: Dr. Gabrielė Balčiūnaitė – Murzienė 1. Konsultantė: Dr. Jūratė Karosienė 2 1 Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmacinių technologijų instituto, Biofarmacinių tyrimų laboratorija, Kaunas 2 Vilniaus Gamtos tyrimų centro, Algologijos ir mikroorganizmų ekologijos laboratorija, Vilnius Darbo tikslas: Nustatyti mikrodumblių melsvabakterių Microcystis biomasės baltymų kiekį, baltymų molekulinę masę ir išskirtų baltymų hemagliutinacinį aktyvumą. Tyrimo objektas: Gineitiškių ežero mikrodumblių melsvabakterių Microcystis biomasė, surinkta Gamtos tyrimų centro Algologijos ir mikroorganizmų ekologijos laboratorijos mokslininkų. Darbo uždaviniai: 1. Išskirti iš melsvabakterių Microcystis biomasės baltymus ir atlikti baltymų kiekio analizę mėginiuose. 2. Nustatyti išskirtų baltymų mėginių dalelių dydį elektroforezės metodu. 3. Nustatyti išskirtų baltymų mėginių hemagliutinacinį aktyvumą in vitro. Metodai: 1. Baltymų išskyrimas iš Microcystis biomasės atliktas ekstrakcijos ultragarso vonelėje metodu, baltymų nusodinimui naudota trichloracto rūgštis (TCA), betamerkapto etanolis ir baltymų plovimo procedūra. 2. Baltymų kiekis nustatytas spektrofotometriniu Lowry metodu, naudojant mikroplokšteles. 3. Baltymų biologinis aktyvumas įvertintas hemagliutinacijos testu, panaudojant triušio, alpakos ir ožkos kraujo mėginių eritrocitų suspensijas. 4. Baltymų dalelių dydžio analizei taikytas elektroforezės poliakrilamido gelyje metodas, naudojant natrio dodecilsulfatą (NaDS-PAGE). Rezultatai: 1. Nustatytas baltymų kiekis tiriamuosiuose mėginiuose – 0,169 ± 0,042 mg/ml. 2. Nustatytas mėginiuose esančių baltymų dalelių dydis 180–200 kDa. 3. Baltymų ekstrakto mėginiai sukėlė triušio ir alpakos kraujo eritrocitų hemagliutinaciją. Apskaičiuotas specifinis hemagliutinacinis aktyvumas (HA) varijavo nuo 0,52 ± 0,02 iki 66,18 ± 2,70 aktyvumo vienetų. Hemagliutinacija neįvyko su ožkos kraujo eritrocitų suspensija. Išvados: 1. Melsvabakterių sudėtyje esantys baltymai buvo efektyviai išskirti, pritaikius ultragarso vonelę, kurioje ultragarso bangos skatino mikrodumblių skaidymąsi, suardant ląstelės sienelę bei pažeidžiant ląstelės plazminės membranos pralaidumą. Pasirinktas Lowry metodas buvo tinkamas kiekybiškai įvertinti tiriamajame mėginyje esančius baltymus. 2. Išskirti baltymai, iš Microcystis melsvabakterių, yra didelės molekulinės masės (180–200 kDa). Gautas baltymų dalelių dydis atitinka Uniprot duomenų bazėje, Microcystis genomo polapyje, patektus tris galimus baltymus kandidatus: 3-hidroksiacil nešiklio baltymo dehidratazės, apoptozės proteazę aktyvuojantys faktoriai bei lektinai su jakalino domenu. 3. Hemagliutinacijos tyrimų rezultatai parodė, jog baltymų ekstrakto mėginių, išskirtų iš mikrodumblių melsvabakterių Microcystis biomasės, sudėtyje yra glikoproteinų – lektinų, sukėlusių agliutinaciją triušio ir alpakos kraujo eritrocitų suspensijų mėginiuose. Reikšminiai žodžiai: Microcystis, mikrodumbliai, melsvabakterės, bioaktyvumas, Lowry, hemagliutinacija, elektroforezė, baltymai